Engineering of Antibody Variable Domains Based on Stable

Human Frameworks

에드워드라쟈  셀바쿠마르

부산대학교 공과대학 화학공학과

요 약

항체의 변이 부위는 그 자체로 항원에 대한 부착 특성을 보이고 있으며, 이러한 성질은 변위 부위 자체를 바이오의료 산업에 다양하게 응용할 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 한편 변이 부위의 안정성 문제는 결국 활성 문제와 관련되어 있으며, 이는 단백질 공학자들의 주요 연구 대상 중의 하나이다. 다른 단백질과 달리 항체 변위 부위의 변이 서열은 적어도 지난 삼십년간 이러한 안정성-활성 문제점 해결에 있어 단백질 공학자들에게 난제로 인식되었으나, 최근 인간유래 항체의 framework(huFR)를 이용한 변위 부위의 안정성 향상에 관한 연구는 이러한 문제점 해결의 실마리를 제공하였다. 본 연구는 huFR을 이용 항체 변위 부위를 개량함으로써 항체 변위 부위를 효율적 사용을 위한 기반 기술을 확립하는데 초점을 두었다. 첫째, huFR과 anti-c-Met scFv의 CDR을 접합함으로써 환원성 세포질인 대장균에서의 접힘이 일어나는 개량 anti-c-Met scFv를 설계, 이의 활성을 확인하였으며, 분자 모델 연구를 통해 12개의 표면 소수성 아미노산의 친수성으로의 변이, 2개의 새로운 이온 결합이 환원성 세포질에서의 단백질 폴딩 효율을 향상 시키는데 기여하는 것을 추정할 있었다. 둘째, 위의 huFR을 이용한 ScFv 개량 방법을 활성 single domain antibody를 설계하는 데 적용, 검증하였다. 분자 모델 연구는 domain-domain interface의 45L 아미노산이 용매에 노출되면서 single domain antibody의 효율적 접힘에 중요한 역할을 하는 것을 보여 주었다. 셋째, 비천연 fluoroproline을 scfv의 proline 위치에 도입함으로써 scFv의 열 안정성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 4R-Fproline의 도입은 단백질의 열 안정성을 향상 시켰으며, scFv의 binding activity에는 큰 영향을 주지 않음을 알 수 있었다. 분자 모델연구는 fluoroproline을 도입함으로써 7개의 새로운 attractive dipole-dipole interaction이 형성됨을 보여 주었다. 마지막으로 huFR과 consensus protein engineering 기법을 이용함으로써 scFv의 내부 methionine이 모두 제거된 scFv 개량법을 고안, 이를 단백질로의 비천연 아미노산 도입 방법과 병행함으로써, N-terminal에 특이적으로 화학적 기능기가 도입된 ScFv를 대장균을 이용해 효율적으로 생산하는 방법을 개발하였다.

Engineering of Antibody Variable

Domains Based on Stable

Human Frameworks

Selvakumar Edwardraja

Department of Chemical Engineering

The Graduate School

Pusan National University

Abstract

The variable domains alone can fulfill the binding function of an intact antibody to a specific target molecule. This functional property enabled their vast usage on many biomedical applications. But their structural separation of variable domains from an intact antibody molecule impaired their stability, which in turn adversely affecting the function. This challenges the protein engineers as a problem of structure function relationship. Unlike other proteins the sequence variation of variable domains, which is an icon property of antibodies hindered to solve this problem at least for the past three decades. But the comprehensive analysis on the sequence and structure of the human variable domains paved the way to enable the stability engineering of variable domains based on the stable human frameworks (huFR).

Therefore the current study focused on to use the huFR for their efficient usage for different purposes. The study initiated with the successful demonstration of the use of huFR to engineer the folding of cytoplasmic unstable anti-c-Met scFv. The molecular modeling studies were carried out on the anti-c-Met scFv and its engineered variant, which revealed that the decrease of hydrophobicity on 12 surface sites and 2 ionic interactions might have improved the folding process efficiently under the reducing cytoplasm of Escherichia coli. We also extended our study on the use of huFR to understand its folding efficiency as single domain format under different cytopalsmic conditions. The study revealed that domain separation adversely affected the folding efficiency of huFR under the reducing cytoplasm, whereas the same process favored under the oxidizing cytoplasm of E. coli. The model based structure analyses indicted the solvent exposure of H45L on the domain interface that strongly hinders the proper folding or leading to the aggregation of heavy chain single domain.

Our next study accomplished the demonstration of a simple strategy to engineer the huFR with fluoroprolines to enhance thermal stability of anti-c-Met scFv. The global replacement of prolines with 4R-FProline on the anti-c-Met scFv improved its thermal stability, which was confirmed by the residual binding activity on high temperature with time. The model based study on the fluorinated anti-c-Met scFv revealed the establishment of 7 new dipole interactions, which might be involved in the thermal stability improvement.

Finally we demonstrated the use of cytoplasmic foldable huFR for an application of N-terminal specific modification as a strategy. The method demonstrated the possibility to design a methionine free cytoplasmic stable anti-c-Met-scFv protein and directly used it for the site specific modification on the N-terminal with bio-orthogonal reactive group.